DESIGN AND CHARACTERIZATION OF YEAST-BASED ELECTROCHEMICAL BIOSENSORS FOR APPLICATION IN PRECISION AGRICULTURE

In recent years, precision agriculture (PA) has garnered significant interest due to its substantial agronomical advantages. At the heart of PA lie advanced sensing technologies, which offer rapid, cost-effective, and skill-independent detection solutions. Among these cutting-edge technologies are electrochemical biosensors. These biosensors integrate bioreporters such as living cells, aptamers, DNA, peptides, and antigens within electrochemical transducers, whether electrodes or field-effect transducers. This integration facilitates easy miniaturization, mass production, and seamless incorporation with electronic acquisition systems. Additionally, the devices for collecting current and potential signals are not only affordable and portable but also exhibit low power consumption. Consequently, electrochemical biosensors are poised to deliver point-of-care diagnostics essential for precision agriculture applications. Despite their potential, the industrial adoption of electrochemical biosensors remains limited, primarily due to the insufficient affinity recognition of bioreporters towards targeted analytes. Addressing this gap necessitates the exploration of novel bioreporters. Recently, unicellular microorganisms with robust cell walls, like yeast and bacteria, have garnered significant research interest. Unlike aptamers and enzymes, which require pretreatment, whole-cell biosensors can detect analytes in bioavailable forms. Furthermore, these microorganisms thrive under less stringent growth conditions and can be genetically modified to achieve the desired responses, making them highly suitable for on-site electrochemical applications. One exemplary organism is the yeast species S. cerevisiae, renowned for its resilience in extreme environments, lack of biofilm formation, ethanol production instead of CO2, accessibility, non-pathogenic nature, and, most importantly, its well-characterized metabolism and genome. Additionally, S. cerevisiae has demonstrated the ability to generate electrical signals during the decomposition of organic compounds, positioning it as a model organism for electrochemical sensing. Leveraging the remarkable properties of yeast-based electrochemical biosensors and aiming to pioneer IoT-enabled biosensors for precision agriculture, we developed innovative yeast-based biosensors accompanied by a handheld prototype electrochemical device for point-of-care copper detection. Complementing this, a Python-based web application has been created for the online storage, visualization, and analysis of sample data. The initial phase of this project is dedicated to the design and characterization of yeast-based electrochemical biosensors utilizing a Glassy Carbon Electrode (GCE). This section is meticulously divided into three subsections. The first subsection elucidates the response of the biorecognition element (S. cerevisiae WT cells) in the presence of CuSO4, using standard optical detection techniques. The second subsection delves into the protocols employed for the immobilization of the biorecognition element onto the surface of the GCE using polydopamine (PDA) to fabricate bio-electrodes (biosensors). The final subsection investigates the performance of the developed biosensor through comprehensive electrochemical characterization utilizing a single channel potentiostat. While standard optical detection showed a significant response only at concentrations above 5 mM after 4 hours of incubation with CuSO4, an impressive limit of detection (LoD) of 12.5 µM was achieved using electrochemical detection, boasting an R2 value of 0.956 after 2500 seconds of incubation. The subsequent part of this study centers on the design and characterization of biosensors fabricated with Screen-Printed Electrodes (SPE), incorporating genetic (multiple yeast respiratory mutants) and metabolic (various growth media) approaches to enhance the overall electrochemical response. This section is further bifurcated into two primary parts. Initially, the viability and growth of three S. cerevisiae strains WT, ∆hap4, and ∆rtg2 in varying concentrations of CuSO4 using standard optical detection are evaluated. In the second part, biosensors prepared with immobilized S. cerevisiae WT cells under different growth conditions, and ∆hap4 and ∆rtg2 cells cultured in standard media are examined through electrochemical characterization using a multichannel potentiostat for CuSO4 detection. The SPE-based biosensors with metabolically and genetically manipulated yeast cells exhibit superior performance, achieving a LoD as low as 2.2 µM and an R2 of 0.998. Subsequently, a prototype handheld electrochemical device, capable of in-house biosensor mounting, was assembled. A complementary web application was also developed for the online storage, visualization, and analysis of data acquired from the prototype. The prototype was tested with biosensors prepared by immobilizing WT cells on the SPE surface in the presence of copper, achieving a LoD of 2.9 µM and an R2 of 0.998, closely mirroring the results obtained with a standard laboratory potentiostat. During this work, we also developed a Matlab-based application which provides a rapid and robust quantitative yeast growth analysis from spot plating assay images. The spot plating assay represents a common method for assessing yeast growth in low-throughput laboratory environments, encompassing growth on various nutrient substrates or exposure to particular stressors. The application features a straightforward one-step installation process, an intuitive interface, and streamlined analysis steps in contrast to traditional methods, rendering it a valuable resource for quantifying growth and viability, suitable for both experienced and inexperienced yeast researchers alike.

Negli ultimi anni, l'agricoltura di precisione (PA) ha suscitato un notevole interesse grazie ai suoi significativi vantaggi agronomici. Al centro della PA ci sono le avanzate tecnologie di rilevamento, che offrono soluzioni di rilevamento rapide, economiche e indipendenti dalle competenze. Tra queste tecnologie all'avanguardia ci sono i biosensori elettrochimici. Questi biosensori integrano biorilevatori come cellule viventi, aptameri, DNA, peptidi e antigeni all'interno di trasduttori elettrochimici, sia elettrodi che trasduttori a effetto di campo. Questa integrazione facilita la miniaturizzazione, la produzione di massa e l'incorporazione senza problemi con i sistemi di acquisizione elettronica. Inoltre, i dispositivi per la raccolta di segnali di corrente e potenziale non sono solo convenienti e portatili, ma anche a basso consumo energetico. Di conseguenza, i biosensori elettrochimici sono pronti a fornire diagnosi sul campo essenziali per le applicazioni dell'agricoltura di precisione. Nonostante il loro potenziale, l'adozione industriale dei biosensori elettrochimici rimane limitata, principalmente a causa dell'insufficiente riconoscimento di affinità dei biorilevatori verso gli analiti target. Affrontare questa lacuna richiede l'esplorazione di nuovi biorilevatori. Recentemente, microrganismi unicellulari con pareti cellulari robuste, come lieviti e batteri, hanno suscitato un notevole interesse di ricerca. A differenza degli aptameri e degli enzimi, che richiedono un pretrattamento, i biosensori a cellule intere possono rilevare gli analiti in forme bio-disponibili. Inoltre, questi microrganismi prosperano in condizioni di crescita meno rigorose e possono essere modificati geneticamente per ottenere le risposte desiderate, rendendoli altamente adatti per applicazioni elettrochimiche in loco. Un organismo esemplare è la specie di lievito S. cerevisiae, nota per la sua resilienza in ambienti estremi, la mancanza di formazione di biofilm, la produzione di etanolo invece di CO2, l'accessibilità, la natura non patogena e, soprattutto, il suo metabolismo e genoma ben caratterizzati. Inoltre, S. cerevisiae ha dimostrato la capacità di generare segnali elettrici durante la decomposizione dei composti organici, posizionandosi come un organismo modello per il rilevamento elettrochimico. Sfruttando le notevoli proprietà dei biosensori elettrochimici a base di lievito e mirando a sviluppare biosensori abilitati per l'IoT per l'agricoltura di precisione, abbiamo sviluppato biosensori innovativi a base di lievito accompagnati da un prototipo di dispositivo elettrochimico portatile per il rilevamento sul campo del rame. A completare questo, è stata creata un'applicazione web basata su Python per l'archiviazione online, la visualizzazione e l'analisi dei dati dei campioni. La fase iniziale di questo progetto è dedicata alla progettazione e caratterizzazione dei biosensori elettrochimici a base di lievito utilizzando un elettrodo di carbonio vetroso (GCE). Questa sezione è meticolosamente divisa in tre sottosezioni. La prima sottosezione spiega la risposta dell'elemento di bioriconoscimento (cellule WT di S. cerevisiae) in presenza di CuSO4, utilizzando tecniche standard di rilevamento ottico. La seconda sottosezione approfondisce i protocolli impiegati per l'immobilizzazione dell'elemento di bioriconoscimento sulla superficie del GCE utilizzando la polidopamina (PDA) per fabbricare bio-elettrodi (biosensori). L'ultima sottosezione esamina le prestazioni del biosensore sviluppato attraverso una caratterizzazione elettrochimica completa utilizzando un potenziostato a canale singolo. Mentre il rilevamento ottico standard ha mostrato una risposta significativa solo a concentrazioni superiori a 5 mM dopo 4 ore di incubazione con CuSO4, è stato raggiunto un impressionante limite di rilevamento (LoD) di 12,5 µM utilizzando il rilevamento elettrochimico, con un valore di R2 di 0,956 dopo 2500 secondi di incubazione. La parte successiva di questo studio si concentra sulla progettazione e caratterizzazione dei biosensori fabbricati con elettrodi serigrafati (SPE), incorporando approcci genetici (mutanti respiratori multipli del lievito) e metabolici (vari mezzi di crescita) per migliorare la risposta elettrochimica complessiva. Questa sezione è ulteriormente suddivisa in due parti principali. Inizialmente, vengono valutate la vitalità e la crescita di tre ceppi di S. cerevisiae WT, ∆hap4 e ∆rtg2 in varie concentrazioni di CuSO4 utilizzando il rilevamento ottico standard. Nella seconda parte, i biosensori preparati con cellule WT di S. cerevisiae immobilizzate in diverse condizioni di crescita e cellule ∆hap4 e ∆rtg2 coltivate in mezzi standard vengono esaminati attraverso la caratterizzazione elettrochimica utilizzando un potenziostato multicanale per il rilevamento di CuSO4. I biosensori basati su SPE con cellule di lievito manipolate metabolicamente e geneticamente mostrano prestazioni superiori, raggiungendo un LoD fino a 2,2 µM e un R2 di 0,998. Successivamente, è stato assemblato un prototipo di dispositivo elettrochimico portatile, capace di montare biosensori in-house. È stata anche sviluppata un'applicazione web complementare per l'archiviazione online, la visualizzazione e l'analisi dei dati acquisiti dal prototipo. Il prototipo è stato testato con biosensori preparati immobilizzando cellule WT sulla superficie SPE in presenza di rame, raggiungendo un LoD di 2,9 µM e un R2 di 0,998, rispecchiando da vicino i risultati ottenuti con un potenziostato da laboratorio standard. Durante questo lavoro, abbiamo anche sviluppato un'applicazione basata su Matlab che fornisce un'analisi quantitativa rapida e robusta della crescita del lievito dalle immagini dei saggi di placcatura spot. Il saggio di placcatura spot rappresenta un metodo comune per valutare la crescita del lievito in ambienti di laboratorio a bassa produttività, includendo la crescita su vari substrati nutrienti o l'esposizione a particolari stressori. L'applicazione presenta un processo di installazione semplice in un solo passaggio, un'interfaccia intuitiva e passaggi di analisi semplificati rispetto ai metodi tradizionali, rendendola una risorsa preziosa per quantificare la crescita e la vitalità, adatta sia per ricercatori esperti che inesperti del lievito