Design and characterization of yeastbased electrochemical biosensors for application in precision agriculture

In recent years, precision agriculture (PA) has garnered significant interest due to its substantial agronomical advantages. At the heart of PA lie advanced sensing technologies, which offer rapid, cost-effective, and skill-independent detection solutions. Among these cutting-edge technologies are electrochemical biosensors. These biosensors integrate bioreporters such as living cells, aptamers, DNA, peptides, and antigens within electrochemical transducers, whether electrodes or field-effect transducers. This integration facilitates easy miniaturization, mass production, and seamless incorporation with electronic acquisition systems. Additionally, the devices for collecting current and potential signals are not only affordable and portable but also exhibit low power consumption. Consequently, electrochemical biosensors are poised to deliver point-of-care diagnostics essential for precision agriculture applications. Despite their potential, the industrial adoption of electrochemical biosensors remains limited, primarily due to the insufficient affinity recognition of bioreporters towards targeted analytes. Addressing this gap necessitates the exploration of novel bioreporters. Recently, unicellular microorganisms with robust cell walls, like yeast and bacteria, have garnered significant research interest. Unlike aptamers and enzymes, which require pretreatment, whole-cell biosensors can detect analytes in bioavailable forms. Furthermore, these microorganisms thrive under less stringent growth conditions and can be genetically modified to achieve the desired responses, making them highly suitable for on-site electrochemical applications. One exemplary organism is the yeast species S. cerevisiae, renowned for its resilience in extreme environments, lack of biofilm formation, ethanol production instead of CO2, accessibility, non-pathogenic nature, and, most importantly, its well-characterized metabolism and genome. Additionally, S. cerevisiae has demonstrated the ability to generate electrical signals during the decomposition of organic compounds, positioning it as a model organism for electrochemical sensing. Leveraging the remarkable properties of yeast-based electrochemical biosensors and aiming to pioneer IoT-enabled biosensors for precision agriculture, we developed innovative yeast-based biosensors accompanied by a handheld prototype electrochemical device for point-of-care copper detection. Complementing this, a Python-based web application has been created for the online storage, visualization, and analysis of sample data. The initial phase of this project is dedicated to the design and characterization of yeast-based electrochemical biosensors utilizing a Glassy Carbon Electrode (GCE). This section is meticulously divided into three subsections. The first subsection elucidates the response of the biorecognition element (S. cerevisiae WT cells) in the presence of CuSO4, using standard optical detection techniques. The second subsection delves into the protocols employed for the immobilization of the biorecognition element onto the surface of the GCE using polydopamine (PDA) to fabricate bio-electrodes (biosensors). The final subsection investigates the performance of the developed biosensor through comprehensive electrochemical characterization utilizing a single channel potentiostat. While standard optical detection showed a significant response only at concentrations above 5 mM after 4 hours of incubation with CuSO4, an impressive limit of detection (LoD) of 12.5 µM was achieved using electrochemical detection, boasting an R2 value of 0.956 after 2500 seconds of incubation. The subsequent part of this study centers on the design and characterization of biosensors fabricated with Screen-Printed Electrodes (SPE), incorporating genetic (multiple yeast respiratory mutants) and metabolic (various growth media) approaches to enhance the overall electrochemical response. This section is further bifurcated into two primary parts. Initially, the viability and growth of three S. cerevisiae strains WT, ∆hap4, and ∆rtg2 in varying concentrations of CuSO4 using standard optical detection are evaluated. In the second part, biosensors prepared with immobilized S. cerevisiae WT cells under different growth conditions, and ∆hap4 and ∆rtg2 cells cultured in standard media are examined through electrochemical characterization using a multichannel potentiostat for CuSO4 detection. The SPE-based biosensors with metabolically and genetically manipulated yeast cells exhibit superior performance, achieving a LoD as low as 2.2 µM and an R2 of 0.998. Subsequently, a prototype handheld electrochemical device, capable of in-house biosensor mounting, was assembled. A complementary web application was also developed for the online storage, visualization, and analysis of data acquired from the prototype. The prototype was tested with biosensors prepared by immobilizing WT cells on the SPE surface in the presence of copper, achieving a LoD of 2.9 µM and an R2 of 0.998, closely mirroring the results obtained with a standard laboratory potentiostat. During this work, we also developed a Matlab-based application which provides a rapid and robust quantitative yeast growth analysis from spot plating assay images. The spot plating assay represents a common method for assessing yeast growth in low-throughput laboratory environments, encompassing growth on various nutrient substrates or exposure to particular stressors. The application features a straightforward one-step installation process, an intuitive interface, and streamlined analysis steps in contrast to traditional methods, rendering it a valuable resource for quantifying growth and viability, suitable for both experienced and inexperienced yeast researchers alike.

Negli ultimi anni, l'agricoltura di precisione (AP) ha suscitato un notevole interesse grazie ai suoi sostanziali vantaggi agronomici. Al cuore dell'AP vi sono le tecnologie di rilevamento avanzate, che offrono soluzioni di rilevamento rapide, convenienti ed indipendenti dalle competenze. Tra queste tecnologie all'avanguardia vi sono i biosensori elettrochimici. Questi biosensori integrano biorilevatori come cellule viventi, aptameri, DNA, peptidi e antigeni all'interno di trasduttori elettrochimici, che possono essere elettrodi o trasduttori ad effetto di campo. Questa integrazione facilita la miniaturizzazione, la produzione di massa e l'incorporazione senza soluzione di continuità con i sistemi di acquisizione elettronica. Inoltre, i dispositivi per la raccolta di segnali di corrente e potenziale non sono solo economici e portatili, ma presentano anche un basso consumo energetico. Di conseguenza, i biosensori elettrochimici sono pronti a fornire diagnosi sul campo essenziali per le applicazioni di agricoltura di precisione. Nonostante il loro potenziale, l'adozione industriale dei biosensori elettrochimici rimane limitata, principalmente a causa del riconoscimento di affinità insufficiente dei biorilevatori verso gli analiti target. Per affrontare questa lacuna è necessaria l'esplorazione di nuovi biorilevatori. Recentemente, i microrganismi unicellulari con pareti cellulari robuste, come lieviti e batteri, hanno suscitato un notevole interesse nella ricerca. A differenza degli aptameri e degli enzimi, che richiedono un trattamento preliminare, i biosensori a cellule intere possono rilevare gli analiti in forme biodisponibili. Inoltre, questi microrganismi prosperano in condizioni di crescita meno rigorose e possono essere modificati geneticamente per ottenere le risposte desiderate, rendendoli altamente adatti per applicazioni elettrochimiche in loco. Un organismo esemplare è la specie di lievito S. cerevisiae, nota per la sua resistenza in ambienti estremi, l'assenza di formazione di biofilm, la produzione di etanolo anziché di CO2, l'accessibilità, la natura non patogena e, soprattutto, il suo metabolismo e genoma ben caratterizzati. Inoltre, S. cerevisiae ha dimostrato la capacità di generare segnali elettrici durante la decomposizione di composti organici, posizionandola come organismo modello per il rilevamento elettrochimico. Sfruttando le proprietà straordinarie dei biosensori elettrochimici a base di lievito e mirando a sviluppare biosensori abilitati all'IoT per l'agricoltura di precisione, abbiamo sviluppato biosensori innovativi a base di lievito accompagnati da un prototipo di dispositivo elettrochimico portatile per la rilevazione sul campo del rame. Complementando ciò, è stata creata un'applicazione web basata su Python per l'archiviazione, la visualizzazione e l'analisi online dei dati dei campioni. La fase iniziale di questo progetto è dedicata alla progettazione e caratterizzazione dei biosensori elettrochimici a base di lievito utilizzando un Elettrodo di Carbonio Vetrificato (GCE). Questa sezione è meticolosamente divisa in tre sottosezioni. La prima sottosezione chiarisce la risposta dell'elemento di bioriconoscimento (cellule WT di S. cerevisiae) in presenza di CuSO4, utilizzando tecniche di rilevamento ottico standard. La seconda sottosezione approfondisce i protocolli impiegati per l'immobilizzazione dell'elemento di bioriconoscimento sulla superficie del GCE utilizzando polidopamina (PDA) per fabbricare bio-elettrodi (biosensori). L'ultima sottosezione indaga le prestazioni del biosensore sviluppato attraverso una caratterizzazione elettrochimica completa utilizzando un potenziostato a canale singolo. Mentre il rilevamento ottico standard ha mostrato una risposta significativa solo a concentrazioni superiori a 5 mM dopo 4 ore di incubazione con CuSO4, è stato ottenuto un impressionante limite di rilevazione (LoD) di 12.5 μM utilizzando il rilevamento elettrochimico, con un valore di R2 di 0.956 dopo 2500 secondi di incubazione. La parte successiva di questo studio si concentra sulla progettazione e caratterizzazione di biosensori fabbricati con Elettrodi Serigrafati (SPE), incorporando approcci genetici (multipli mutanti respiratori di lievito) e metabolici (vari mezzi di crescita) per migliorare la risposta elettrochimica complessiva. Questa sezione è ulteriormente suddivisa in due parti principali. Inizialmente, vengono valutate la vitalità e la crescita di tre ceppi di S. cerevisiae WT, Δhap4 e Δrtg2 in varie concentrazioni di CuSO4 utilizzando il rilevamento ottico standard. Nella seconda parte, i biosensori preparati con cellule WT di S. cerevisiae immobilizzate in diverse condizioni di crescita e cellule Δhap4 e Δrtg2 coltivate in mezzi standard vengono esaminati attraverso la caratterizzazione elettrochimica utilizzando un potenziostato multicanale per la rilevazione di CuSO4. I biosensori basati su SPE con cellule di lievito manipolate metabolicamente e geneticamente mostrano prestazioni superiori, raggiungendo un LoD di soli 2.2 μM e un R2 di 0.998. Successivamente, è stato assemblato un prototipo di dispositivo elettrochimico portatile, capace di montare biosensori internamente. È stata inoltre sviluppata un'applicazione web complementare per l'archiviazione online, la visualizzazione e l'analisi dei dati acquisiti dal prototipo. Il prototipo è stato testato con biosensori preparati immobilizzando cellule WT sulla superficie dell'SPE in presenza di rame, raggiungendo un LoD di 2.9 μM e un R2 di 0.998, rispecchiando strettamente i risultati ottenuti con un potenziostato da laboratorio standard. Durante questo lavoro, abbiamo anche sviluppato un'applicazione basata su Matlab che fornisce un'analisi rapida e robusta della crescita del lievito da immagini di saggi di plating spot. Il saggio di plating spot rappresenta un metodo comune per valutare la crescita del lievito in ambienti di laboratorio a bassa produttività, comprendendo la crescita su vari substrati nutritivi o l'esposizione a particolari stressori. L'applicazione presenta un processo di installazione semplice in un solo passaggio, un'interfaccia intuitiva e fasi di analisi semplificate rispetto ai metodi tradizionali, rendendola una risorsa preziosa per quantificare la crescita e la vitalità, adatta sia a ricercatori esperti che inesperti nel campo del lievito.